Adeno İlişkili Virüs ve Sentetik Biyoloji

Adeno İlişkili Virüs ve Sentetik Biyoloji

Adeno İlişkili Virüs

Adeno İlişki Virüs (AAV) 4.7 kb’lik tek sarmallı DNA (ssDNA) genomuna sahip 25 nm çapında, viral zarfı olmayan bir virüstür(1). Adeno İlişkili Virüs Parvovirüs ailesine aittir ve kendisini replike edebilmesi için, Adenovirüs veya Herpesvirüs gibi başka virüslerle etkileşime geçmesi gerekmektedir. 

Şekil 1 Adeno İlişkili Virüs ve kapsid yapısı(2)

Tek sarmallı genomu Rep (Replikasyon), Cap (Capsid) ve aap’den oluşan üç adet gen içerir. Bu üç gen, farklı splicing yoluyla en az 9 gen ürününe yol açar. Kodlama dizileri, genom replikasyonu ve paketleme için gerekli olan ters çevrilmiş terminal tekrarları (ITR’leri) içerir(3). Rep geni viral replikasyon, paketleme ve yapısal entegrasyonda yer alan yapısal olmayan proteinler kodlar. Cap geni ise viral gen dağıtım aracı olarak görev yapan, viral kapsidi oluşturmak için bir araya gelen yapısal proteinleri (VP1, VP2, VP3) kodlar(4).

Şekil 2 AAV ve AAV vektörlerinin yapısı(5)

Gen Tedavisi İçin Vektör Olarak Adeno İlişkili Virüs

Adeno İlişkili Virüs (AAV) gen terapisi uygulamalarında spesifik işlevsellik için tasarlanabilen çok yönlü bir viral vektördür. Bugüne kadar, AAV’nin klinik ortamlarda güvenli ve etkili olduğu gösterilmiştir. AAV biyolojik ve biyofiziksel özellikleri nedeniyle çok sayıda hastalıkta çok çeşitli klinik uygulamalarda kullanılabilir(6).

Doğal tip AAV çoğu zaman gen terapötikleri oluşturmak için kullanılan bir form değildir. Viral DNA’ya sahip olmayan rekombinant Adeno İlişkili Virüs (rAAV), başka bir hücrenin çekirdeğine genomunu aktarmak üzere tasarlanmış protein bazlı bir nanoparçacıktır.  Rekombinant epizomal DNA konak hücre genomlarına entegre olmadığından, hücre yinelenen replikasyona maruz kaldıkça zaman ile seyreltilecektir. Bu durum en sonunda transgen ve transgen ekspresyonunun kaybıyla sonuçlanacak ve transgen kaybının oranı, transdüksiyona tabi tutulan hücrenin devir hızına bağlı olacaktır. Bu özellikler rAVV’yi gen terapisi uygulamaları için ideal hale getirir.

Şekil 3 Rekombinant AAV (rAAV) gen transfer vektörü içinde paketlenmiş bir gen ekinin bileşenlerinin şematik gösterimi

Çoğu biyoterapötik gibi AAV’nin canlı bir sistemde üretilmesi gerekir.

Şekil 4  Rekombinant Adeno İlişkili Virüs (rAAV) üretimi(7)

Terapötik gen iletimi için AAV kullanmanın dezavantajlarından biri küçük paketleme kapasitesidir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, AAV kapsidine verimli bir şekilde paketlenebilen en büyük gen ürününün yaklaşık 5 kb uzunluğunda olduğunu göstermiştir(8).

Kanser Gen Tedavisinde Adeno İlişki Virüs (AAV) Vektörleri

Kanser için gen tedavisi, katı ve hematopoietik maligniteleri olan hastalarda sonunda tümör hücrelerinin yok edilmesine yol açacak yeni tedavi paradigmaları sunar. Tümör hücrelerini doğrudan hedefleyen başlıca kanser geni terapisi yaklaşımları arasında kemosentinizasyon, sitokin gen transferi, proto-onkojen ekspresyonunun inaktivasyonu, kusurlu tümör baskılayıcı genlerin değiştirilmesi ve onkolitik virüslerin transdüksiyonu yer alır. Bu yaklaşımların büyük çoğunluğu adenoviral vektörler ve daha az ölçüde retroviral vektörler kullanılarak denenmiştir. Adeno İlişkili Virüs (AAV) esaslı vektörler, kanser gen terapisi potansiyeli olan vektörlerdir(9). AAV vektörleri kemoterapi ile birleştirildiğinde azalmış tümör hacimleri için hafif bir eğilim gözlemlenmişti(10).

Adeno İlişkili Virüs (AAV) Aracılı CRISPR-Cas9 Gen Düzenleme 

Rekombinant Adeno İlişkili Virüs, gen iletimi için diğer virüs türlerine göre çeşitli avantajlara sahiptir. AAV Cas9’un genomik entegrasyonunu ve sürekli ekspresyonunu engelleyerek konakçı genomuna entegre olmaz, böylece Cas9’un hedef dışı etkilerinin olasılığını azaltır. AAV daha düşük immünojenisite sergiler ve diğer entegre olmayan virüslere (Örn. Adenovirüs) küçük bir genoma sahiptir, bu da manipüle edilmesini kolaylaştırır. 

Şekil 5 Tam uzunlukta Cas9 üretmek için AAV vektör kombinasyonu(11)
Şekil 6 AAV vektör aracılı gRNA ve Cas9 ifadesi(12)
A)    Huh7 ve HEK293T hücrelerinin, bir GFP haberci taşıyan gRNA kodlayan AAV vektörlerinin iletilmesinden sonra transdüksiyon verimliliği.
B)     Cas9 veya gRNA yapılarının sırasıyla HEK293T hücrelerine transfeksiyonundan (plazmidle gösterilir) veya transdüksiyonundan (virüsle gösterilir) sonra indel yüzdeleri. 
C)     HEK293T hücrelerine miR122’ye karşı Cas9/gRNA yapısının transfeksiyonu veya transdüksiyonundan sonra indel yüzdelerinin karşılaştırılması. Sayılar saflaştırılmış virüsler için kullanılan çok sayıda enfeksiyonu (hücre başına parçacık) gösterir.
D)    Temel CMV-Cas9 yapısının modifikasyonlarını gösteren şema.
E)     Güçlü çekirde promoter 1’i CMV’den 100 bp’lik bir güçlendirici element ve SV40’tan 135 bp’lik bir güçlendirici element ile birleştirerek Cas ekspresyonu için kimerik bir promoterin oluşturulması.
F)     Karaciğer hücrelerinden Cas9 ekspresyonunun hedefinin belirlenmesi.
 

REFERANSLAR

  1. Salmulski RJ, Muzyczka N. Araştırma ve Terapötik Amaçlar için AAV Aracılı Gen Terapisi. Annu.Rev. Virol. 2014;1:427-451. doi: 10.1146/annurev-virology-031413-085355
  2. Lauren M Drouin, Mavis Agbandje-McKenna, Adeno-associated virus structural biology as a tool in vector develoment, 2013 Dec;8(12): 1183-1199. doi: 10.2217/fvl.13.112
  3. Salmulski RJ, Muzyczka N. Araştırma ve Terapötik Amaçlar için AAV Aracılı Gen Terapisi. Annu.Rev. Virol. 2014;1:427-451. Doi: 10.1146/annurev-virology-031413-085355
  4. Sonntag F, Schmidt K, Kleinschmidt JA. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010 May 7. doi:10.1072/pnas.1001673107
  5. Jorge L. Santiago-Ortiz ve David V. Schaffer. Adeno-AssociatedVirus (AAV) Vectors in Cancer Gene Therapy. 2016 Jan 12. doi: 10.1016/j.jconrel.2016.01.001
  6. Michael F. Naso, Brian Tomkowicz, William L. Perry, William R. Strohl. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. 2017 Jul 1. doi: 10.007/s40259-017-0234-5
  7. Selvarangan Ponnazhagan, David T. Curiel, Denise R. Shaw, Ronald D. Alvarez and Gene P. Siegal, Adeno-associated Virus for Cancer Gene Therapy, doi: September 2001
  8. Lauren M Drouin, Mavis Agbandje-McKenna, Adeno-associated virus structural biology as a tool in vector develoment, 2013 Dec;8(12): 1183-1199. doi: 10.2217/fvl.13.112
  9. Selvarangan Ponnazhagan, David T. Curiel, Denise R. Shaw, Ronald D. Alvarez and Gene P. Siegal, Adeno-associated Virus for Cancer Gene Therapy, doi: September 2001
  10. Johanna Reul, Janina Frisch, Christine England, Frederic B. Thalheimer, Jessica Hartmann, Guy Ungerechts, Christian J. Buchholz. Tümöre Özgü İmmün Kontrol Noktası İnhibitörlerinin Tasarlanmış AAV Vektörleri Tarafından Sağlanması. doi: 10.3389/fonc.2019.00052
  11. Improved CRISPR/Cas9 genome editing in hard-to-transfect mammalian cells using AAV
  12. Elena Senis Chronis Fatouros Stefanie Große Ellen Wiedtke Dominik Niopek Ann-Kristin Mueller Kathleen Börner Dirk Grimm. CRISPR/Cas9-mediated genome engineering: An adeno-associated viral (AAV) vector toolbox. 04 Sempember 2014 https://doi.org/10.1002/biot.201400046

YAZAR

  • İlkyaz Aslantaş

1 yorum

Bir cevap yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir